DASbox® Mini Bioreactor System과 BioBLU® 0.3c 일회용 바이오리액터로 배양한 hADSC 조건화 배지에서, High-Speed Centrifuge CR22N과 Ultracentrifuge CP100NX를 이용해 4시간 이내에 순수하고 균질한 소형 EV(엑소좀)를 분리하는 워크플로우를 확인해 보세요.
엑소좀(30~150 nm)을 포함한 세포외 소포체(EV)는 핵산·단백질·지질 등 생체분자를 세포 간에 전달하며, 질환 바이오마커 및 차세대 약물전달체로 주목받고 있습니다. 그러나 낮은 수율과 표준화된 생산 플랫폼의 부재는 여전히 해결해야 할 과제입니다.
본 노트에서는 지방유래 줄기세포(hADSC)를 마이크로캐리어 기반으로 배양한 뒤, 고속원심분리와 초원심분리를 병합하여 소형 EV를 빠르고 간편하게 분리하는 공정을 소개합니다.
hADSC를 Synthemax® II 마이크로캐리어에 접종하여 DASbox Mini Bioreactor System에 장착된 BioBLU 0.3c 일회용 바이오리액터에서 배양(교반 80 rpm, DO 40%, 37 °C, pH 7.2)했습니다. 5일간 증식 후 배지를 RoosterCollect-EV로 교체하여 48시간 동안 EV를 수집했으며, 최종 세포 생존율은 97%, 밀도는 1.96 × 10⁶ cells/mL를 기록했습니다.
세 단계 모두 고정각 로터 R15A를 장착한 High-Speed Centrifuge CR22N을 사용했으며, 10 × 50 mL + 10 × 15 mL 튜브를 동시에 수용해 두 바이오리액터(총 650 mL)의 배지를 1시간 이내에 한 번에 정제할 수 있었습니다.
정제된 배지는 스윙버킷 로터 P32ST를 장착한 Ultracentrifuge CP100NX로 100,000 × g에서 90분씩 2회 원심분리했습니다. 40PET 튜브(6 × 40 mL)를 사용해 두 바이오리액터 전체 배지 처리에 단 2회의 러닝만 필요했습니다. 직접 초원심분리법과 튜브 바닥에 30% 수크로스 쿠션을 둔 방법을 비교했습니다.
분리된 소형 EV는 Dynamic Light Scattering(DLS)으로 입자 크기 분포를, 투과전자현미경(TEM)으로 형태를, CD63 ELISA로 엑소좀 마커 발현을 각각 분석했습니다. RoosterCollect-EV 배지는 음성 대조군으로 사용했습니다.
DLS 및 TEM 분석 결과, 수크로스 쿠션을 사용하지 않은 소형 EV 집단은 입자가 더 크고 이질적이었던 반면, 수크로스 쿠션을 사용한 분획은 더 작고 균질하며 잔여물도 적었습니다. CD63 ELISA에서는 두 분리법 간 엑소좀 마커 발현의 상대적 풍부도가 유사하게 나타나, 두 방법 모두 소형 EV 수득률을 잘 확보함을 확인했습니다.
| 장비 / 로터 | 용량 | 최대 속도 |
|---|---|---|
| Centrifuge CR22N + Rotor R15A | 10 × 50 mL + 10 × 15 mL (최대 650 mL) | 32,300 × g |
| Ultracentrifuge CP100NX + Rotor P32ST | 6 × 40 mL (최대 240 mL) | 803,000 × g |
hADSC 유래 소형 EV 분리,
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The swing-bucket rotor S-4xUniversal cannot only spin volumes up to 4 x 1 L, with the unique universal adapters it makes lab life even easier: For the first time, this innovative system allows centrifugation of tubes, plates, and bottles without the need to change centrifuge rotors, rotor buckets, or adapters.
New rotor FA-6x250 extends application range of large benchtop Centrifuges 5910 Ri and 5920 R. This includes harvesting of bacteria, algae and yeast, as well as mammalian cells in vessels up to 250 mL.
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